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DNAのアルキル化損傷により生じるO^6-メチルグアニン(O^6-meG)は、DNA複製過程に塩基の誤対合を形成し、突然変異をひき起こす。その抑制機構として、我々生物は、O^6-meGのような傷をもつ細胞にアポトーシスを誘導し、これらの細胞を集団から排除する。本年度は、O^6-meGが引きおこすアポトーシスの分子機構を明らかにするために、遺伝学的手法を用いて新規アポトーシス誘導因子の同定を行った。
1、薬剤耐性遺伝子をもつレトロウイルスベクターを用いた遺伝子トラップ法により遺伝子破壊株ライブラリーを構築し、その中からアルキル化剤MNUに抵抗性を示す突然変異細胞株を分離した。その中の1つKH101株は、MNUに対する抵抗性を示すものの、MMS、ACNU、エトポシド、紫外線照射には感受性のままであった。
2、MNU処理されたKH101細胞株では、CHK1のリン酸化などのDNA損傷シグナルの活性化は観察されたが、アポトーシス誘導の指標となるミトコンドリア膜の透過性の亢進やカスパーゼ3の活性化は見られなかった。そしてこの時、突然変異頻度がコントロール細胞に比べて優位に上昇していた。
3、KH101株における破壊遺伝子を同定し、我々はこの遺伝子をMapol (O^6-methylguanine-induced apoptosis 1)と名付けた。データベースを検索したところ、Mapol遺伝子は線虫からヒトまで種を超えて広く保存されていることがわかった。Mapol遺伝子に特異的なsiRNAを用いた遺伝子ノックダウン細胞では、MNU処理によるアポトーシス誘導が顕著に抑制された。
4、ヒトおよびマウスに由来するMAPO1タンパク質をEGFPと融合して細胞内で発現させたところ、どちらのEGFP-MAPO1タンパク質とも細胞質に優先的に局在することが観察された。
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