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DNAのアルキル化損傷により生じるO^6-メチルグアニン(O^6-meG)は、DNA複製過程に塩基の誤対合を形成し、突然変異をひき起こす。その抑制機構として、生物は、O^6-meGのような変異原性の傷をもつ細胞に自らアポトーシスを誘導し、これらの細胞を集団から排除する機構を備え持っている。本年度は、O^6-meGが引きおこすアポトーシスの分子機構を明らかにするために、遺伝学的手法により同定した新規アポトーシス誘導因子MAPO1の機能解析を行った。
1、細胞内ではMAPO1タンパク質は複合体を形成して機能していることが予想されたので、Flagタグを付加したMAPO1タンパク質を細胞内で一過的に発現させ、これと相互作用するタンパク質を免疫沈降法により単離した。その結果、MAPO1タンパク質は、細胞内のエネルギーレベルに応答するAMPKとがん抑制遺伝子のひとつであるFLCNと相互作用することが明らかになった。
2、siRNAを用いた遺伝子ノックダウン法によりAMPKとFLCN遺伝子の機能を検証したところ、AMPKとFLCNの両遺伝子は、O^6-meGによって引き起こされるアポトーシス誘導において機能することが明らかになった。
3、野生型の細胞ではAICAR(AMPKの特異的なアクチベーター)処理によりアポトーシスを誘導できるが、Mapol欠損株ではこの誘導は見られなかった。このことは、MAPO1がAMPKの活性化調節に関与することを示唆している。
4、MAPO1の発がん抑制における機能を調べるために、Mapo1遺伝子が破壊されたES細胞を分離した。
その後、遺伝子破壊ES細胞を用いてMapo1遺伝子欠損マウスの作出を行った。
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