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アフリカツメガエル変態期の小腸では、甲状腺ホルモン(TH)を引き金として幹細胞が出現し、哺乳類類似の成体型上皮が新たに形成される。本研究では、この小腸を用いて以下の実験を行い、消化管上皮幹細胞ニッチの分子的実体の解明を目指す。
(1)熱ショック蛋白質プロモーターの下流にdominant positive型TH受容体遺伝子を導入したトランスジェニックカエル(dpTRカエル) および野生型カエルの幼生より小腸を摘出し、上皮を結合組織から分離する。各組織を再結合させることにより、上皮、結合組織共にdpTRカエル由来の小腸(A)、上皮のみがdpTRカエル由来の小腸(B)、結合組織のみがdpTRカエル由来の小腸(C)、上皮、結合組織共に野生型カエル由来の小腸(D)、の4種類の小腸を作る。熱ショックをかけながら各小腸をTH 非存在下で培養した後、生じる上皮の変化(幹細胞の出現、増殖、分化、アポトーシス等)を免疫組織学的に解析する。A～Dの結果を比較することにより、組織依存的に発現するdpTRによって成体型上皮形成がどの段階まで進行するのかを明らかにする。
(2)TRはTH応答遺伝子の発現を調節することが知られている。そこで、ツメガエル小腸でクローニングされた一連のTH応答遺伝子について、変態期および上記A～Dの小腸における発現をRT-PCRおよびin situ hybridization (ISH)により解析する。各遺伝子の発現パターンと上皮形成との関連を調べることにより、幹細胞の出現、増殖、分化に関与する遺伝子の候補を見つけ出す。
(3)幹細胞制御への関与が予測される遺伝子について、順次、機能解析を行う。申請者らが独自に開発した培養アッセイ系を用い、当該遺伝子の発現変化が幹細胞に及ぼす影響を、免疫組織化学的解析により明らかにする。
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