| 研究概要 |
原生生物テトラヒメナ(Tetrahymena pyriformis)の繊毛運動の持続のためには,ATPの連続的な供給が必要であり,それはアルギニンキナーゼ(AK)を介した「アルギニンリン酸シャトル」機構によって維持されていると考えられている.我々は,テトラヒメナに分子量の異なる二種類のAK(40kDaのAKI及び遺伝子の重複と融合によって生じた2ドメイン型80kDaのAKII)が含まれることを示した.本年度は,AKIIのリコンビナント酵素の発現と二種類のAKの細胞内局在を明らかにすることを中心に研究を行なった.原生生物の遺伝子では,Glnのコドンが終止コドンで代用されているので,タンパク質発現のためにはこれを通常のものに変異させる必要がある.そのために先ず,2ドメイン型AKIIのGlnのコドン(ドメイン1に2カ所,ドメイン2に3カ所)を,通常のコドンに変異させた.また,Hisタグ(6xHis)を付加したリコンビナント酵素として発現させるために,pETベクターへの乗せ換えた.予備的な実験では,この2ドメイン型酵素は不溶性画分に回収され,可溶性酵素として得ることができなかった.ただし,ドメイン1側のみの部分は可溶化した.次に,AKI,及び可溶化したAKIIのドメイン1部分のリコンビナントタンパク質を用いて,これらを抗原としたマウス・ポリクローナル抗体を作製した。これらの抗体を用いてウエスタンブロッティングを行ったところ,テトラヒメナの細胞全体では,AKIIが強く検出され,AKIはほとんど検出されなかった.一方,ジブカイン処理によって単離された繊毛では,AKIIは検出されず,AKIが強く検出された.即ち,AKIは繊毛に局在していることが明らかになった.
|
