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複製開始反応は細胞周期の決まった時期に1回だけ起きるように厳密に制御されている。本研究では大腸菌細胞周期における複製開始タンパク質DnaAの挙動を解明する目的で以下の研究を行った。
(1)細胞周期におけるDnaAタンパク質の細胞内局在
DnaAの挙動を生細胞内で観察することはこれまで世界各地で試みられていたが困難であった。我々は、ドメインIIの生育に必須でない配列を同定し、その一部分をEYFPと置換することにより初めて観察に成功した。DnaA-EYFP発現株の解析から、DnaAは、これまでの報告と異なって核様体DNA上に存在しており、しかもかなりの部分はDNA上の限られた部位に集合していることを見いだした。さらに、この集合体が細胞周期を通じて複製起点oriCとInitiator titrationに関わる部位datAの間をダイナミックに行き来していることが示唆された。
(2)DnaAタンパク質の細胞内局在を制御する因子の同定
複製を正に制御することが知られているDiaAの欠失下では、複製開始時の細胞でDnaA-EYFP集合体の形成が著しく低下していた。DnaAのoriCへの集合にDiaAが関わっていることが示された。一方、複製を負に制御することが知られているSeqAの欠失下では、複製開始時の細胞でDnaA-EYFP集合体の数が著しく増加していた。SeqAがDnaAのoriCへの集合を阻害していることをビジュアルに示すことが出来た。また、IHFおよびFISがDnaA-EYFP集合体形成の時期と効率の制御に関わっていることが判明した。
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