魚類の低分子結合性タンパク質ーリポカリンの大量発現と静菌活性に関する研究

2010 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 20580221
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 大嶋 雄治 九州大学, 大学院・農学研究院, 教授 (70176874)
• キーワード: リポカリン / 静菌活性 / ヒラメ / 遺伝子組換え体

研究概要

平成22年度は以下の実験を行い以下の成果を得た。
1)組換え体ヒラメリポカリンの細菌に対する静菌活性とシデロフォア結合性の検討
TBT-bp1組換え体(rTBT-bp1)を転移したバキュロウイルスプラスミドを作成し、カイコガに感染させ、その体液より大量に分取精製することに成功した。得られたrTBT-bp1を用いて、魚病細菌としてE.tardaの増殖に及ぼす影響を調べた結果、10%トリプトソイブイヨン区で吸光値がコントロールの68%と有意に低下しその増殖が阻害されていた。よってTBT-bp1が静菌活性を持つ可能性があることが示唆された。
2)組換え体ヒラメリポカリンrTBT-bp1の結合性とその機能の検証
カイコ血中にrTBT-bp2を発現させるため、ヒラメTBT-bp2のコンストラクトを転移したバキュロウィルスを作成し、カイコ5齢幼虫に感染させ、血液中に分泌されたrTBT-bp2を採取しアフィニティークロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。得られたTBT-bp2(4μM in 50mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl)にリポカリン蛍光プローブ(11-(5-(dimethylamino)-1-naphthalene-sulfonylamino) undecanoic acid (DAUDA))との結合を調べた。さらに、4μM TBT-bp2にDAUDA(3μM)を結合させた後、競合基質(500μM TBT、lauric acid、palmitic acid、stearic acid in ethanol)を終濃度3μMとなるまで滴下し、蛍光強度の変化を調べた。その結果DAUDAの濃度上昇とともに蛍光強度が増加した。よってrTBT-bp2にDAUDAが結合することが確認された。またDAUDAを結合させたrTBT-bp2にTBTを滴下した結果、蛍光強度が34%まで減少したことからTBTに対するrTBT-bp2の結合能が証明された。しかし同様に脂肪酸類を滴下したが、蛍光強度の減少は認められず、脂肪酸類はrTBT-bp2に対してDAUDAより結合性は弱いと考えられた。

研究成果

• [雑誌論文] Purification and charac-terization of tributyltin-binding protein of tiger puffer, Takifugu rubripes. (2011)
  • 著者名/発表者名: Oba Y, Yamauchia A, Hashiguchi Y, Satonea H, Miki S, Nassef M, Shimasaki Y, Kitano T, Nakao M, Kawabata S, Honjo T, Oshima Y
  • 雑誌名: Comparative Biology and Physiology part C 巻: 153 ページ: 17-23
  • 査読あり
• [雑誌論文] Molecular cloning, sequencing, and gene expression analysis of tributyltin-binding protein type 1 in Japanese medaka fish, Oryzias latipes. (2011)
  • 著者名/発表者名: Nassef M, Kato-Unoki Y, Furuta T, Nakayama K, Satone H, Shimasaki Y, Honjo T, Oshima Y.
  • 雑誌名: Zoological Science 巻: 28(印刷中)
  • 査読あり
• [雑誌論文] Induction of tributyltin-binding protein type 2 in Japanese flounder, Paralichthys olivaceus, by exposure to tributyltin-d27. (2011)
  • 著者名/発表者名: Nassef M, Tawaratsumida T, oba Y, Satoe H, Nakayama K, Shimasaki Y, Honjo T, Oshima Y.
  • 雑誌名: Marine Pollution Bulletin 巻: 62 ページ: 412-414
  • 査読あり
• [雑誌論文] Tributyltin-binding protein type 1, a lipocalin, prevents inhibition of osteoblastic activity by tributyltin in fish scales. (2011)
  • 著者名/発表者名: Satone H, Lee JM, Oba Y, Kusakabe T, Akahoshi E, Miki S, Suzuki N, Sasayama Y, Nassef M, Shimasaki Y, Kawabata S, Honjo T, Oshima Y
  • 雑誌名: Aquatic Toxicology 巻: (印刷中)
  • 査読あり
• [学会発表] 魚類リポカリンは異物(トリブチルスズやフグ毒)と結合し体表粘液から排泄する機能を持つ (2010)
  • 著者名/発表者名: 大嶋雄治
  • 学会等名: 環境ホルモン学会
  • 発表場所: 東京大学
  • 年月日: 20101216-20101217
• [学会発表] Toxic responses of embryos of Japanese medaka fish (Oryzias latipes) to pharmaceuticals and personal care products using in ovo nanoinjection Poster (2010)
  • 著者名/発表者名: Nassef M, Seki M, Shimasaki Y1, Oshima Y
  • 学会等名: Society of Environmental Toxicology and Chemistry Asia Pacific 2010
  • 発表場所: 広州(中華人民共和国)
  • 年月日: 20100604-20100608
• [学会発表] THE DETOXIFICATION AND EXCRETION FUNCTION OF TRIBUTYLTIN BINDING PROTEIN IN JAPANESE FLOUNDER, Paralichthyes olivaceus Platform. (2010)
  • 著者名/発表者名: Oshima Y, Satone H, Yumi Oba Y, Lee JM, Kusakabe T, Kawabata S, Shimasaki Y, Suzuki N, Sasayama Y.
  • 学会等名: Society of Environmental Toxicology and Chemistry Asia Pacific 2010
  • 発表場所: 広州(中華人民共和国)
  • 年月日: 20100604-20100608
• [学会発表] GENE EXPRESSION PROFILE IN MEDAKA FISH EXPOSED TO TRICLOSAN, DICLOFENAC AND CARBAMAZEPINE POSTER (2010)
  • 著者名/発表者名: M Nassef, Y K Unoki, Y Shimasaki, Y Oshima
  • 学会等名: 第6回International Conference on Marine Pollution and Ecotoxicology
  • 発表場所: 香港(中華人民共和国)
  • 年月日: 20100531-20100603
• [学会発表] INDUCTION OF THE TRIBUTYLTIN-BINDING PROTEIN 2 OF JAPANESE FLOUNDER, Paralichthys olivaceus BY EXPOSURE OF TRIBUTYLTIN-d27 Poster (2010)
  • 著者名/発表者名: Y Oshima, T.Tawaratsumida, Y OBA, H SATONE, Y SHIMASAKI
  • 学会等名: 第6回International Conference on Marine Pollution and Ecotoxicology
  • 発表場所: 香港(中華人民共和国)
  • 年月日: 20100531-20100603
• [学会発表] Tributyltin-binding protein type 1 rescued the inhibition of osteoblastic activity induced by TBT Poster Miki S., Ikeda K., Oba Y., Satone H., Shimasaki Y., Onikira N., Arakawa O, Oshima Y. Accumulation of tributyltin in the blood of pufferfish (2010)
  • 著者名/発表者名: Satone H., Lee J.M., Kusakabe T., Kawabata, S., Suzuki N., Sasayama Y., Oba Y., Shimasaki Y., Oshima Y.
  • 学会等名: Society of Environmental Toxicology and Chemistry
  • 発表場所: Sevillia Spain
  • 年月日: 20100522-20100529
• [学会発表] Synergistic toxicities of diazinon, fenitrothion and benthiocarb on Daphnia magna Poster (2010)
  • 著者名/発表者名: Oshima, Y., Tanoue W., Kawaguchi, A., Yanagawa T., Shimasaki, Y.
  • 学会等名: Society of Environmental Toxicology and Chemistry
  • 発表場所: Sevillia Spain
  • 年月日: 20100522-20100529
• [学会発表] Analysis of the tribu-tyltin-binding protein gene of Japanese flounder, Paralichthys olivaceus. POSTER (2010)
  • 著者名/発表者名: Oshima, Y., Ooba Y., Satone H., Shimasaki, Y., Hashiguchi, Y.
  • 学会等名: Society of Environmental Toxicology and Chemistry
  • 発表場所: Sevillia Spain
  • 年月日: 20100522-20100529
• [備考]
  • URL: http://bbs1.agr.kyushu-u.ac.jp/biosci-biotech/kankyo/publication.html