| 研究概要 |
平成20年度は、ウシおよびヒツジレコンビナントPrPを作成した。また、REPSA法に用いるoligoDNAの設計およびライブラリーを作成した。
1.ウシおよびヒツジPrPのcDNAクローニング
ウシおよびヒツジPrP塩基配列(GenBank accession No.AJ298878 bovine PrP 25-242,GenBank accession No.U67922 sheep PrP25-234)を参考に、酵素認識サイトを付加したプライマーを設計しPCR法にてPrP蛋白翻訳領域のDNAを増幅した。
2.大腸菌発現系を用いたレコンビナントPrPの発現およびカラム法による精製
(1)ウシおよびヒツジレコンビナントPrPの発現
大腸菌発現ベクターを用いて、ヒスチジンTag付レコンビナントPrPを発現させた。
(2)カラムによる精製
Ni-NTAカラムにより、ヒスチジンTag付レコンビナントPrPを精製した。
3.REPSA法を用いた、PrP結合DNA断片の配列決定
(1)oligoDNAライブラリーの作成
Michae1らの方法(Methods 2007)を参考に、FokIおよびBpmI認識配列を断端に有し中央部がランダム配列のoligoDNAライブラリーを作成した。
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