| 研究概要 |
申請者は現在までにMATEのプロトタイプのVibrio Parahaemolyticus由来のNorMに関して機能性アミノ酸残基を同定している(J Bacteriol,2005)。NorMの薬物輸送に関与する機能性アミノ酸残基は、膜貫通領域に存在している酸性アミノ酸残基であった。バクテリア由来のMATEトランスポーターのNorMは、ヒトMATE1とタンパク質レベルで23.6%の相同性しかないが、これらの酸性アミノ酸残基のうちの2つはヒト及びマウスのMATE1及びMATE2で保存されていた。以上のことから、哺乳類のMATEにおいてもこれらの酸性アミノ酸残基を含む極性アミノ酸残基が、MATEの基質認識機構や、プロトンとの交換輸送機構に直接関係していることが予想される。これらの予想を基にMATE1の点変異体を複数作製した。(MATEの極性残基部分:E278A,E319A,H386A,E389A等)。そして、TEA(テトラエチルアンモニウム)の取り込み活性に与える影響をRIトレーサー実験により調べた。この結果より機能性アミノ酸残基を決定した。また、MATE1変異体の基質特異性や、輸送活性に及ぼすpHの影響に対する変化についても詳細に解析を行うことによって、OC/H+交換輸送における基質認識機構や、プロトンとの交換輸送機構を解明した。ヒトMATE1の膜貫通領域にある極性アミノ酸のうち、E273Qの点変異体を作成しHEK293細胞に発現させたところ、TEAの輸送活性は完全に消失した(PNAS2005,)。また、MATE1の機能と構造を理解する上でその分子単体に注目し、大量発現・精製及びそのリポソームへの再構成系を確立した。大量発現系は、昆虫細胞を用いた発現系を用いた。また、大量発現したタンパク質を精製・リポソームに再構成し、活性の測定を行う系を構築した。こうした技術をMATEタンパク質の機能解析に応用した。そして輸送測定で基質とH+の化学平衡を測定した。
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