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DNA損傷はがん細胞選択的な細胞死を引き起こす。この機構として、がん細胞では癌抑制経路の異常によりDNA損傷が生じても細胞周期は進行し、G2チェックポイントを乗り越えM期に侵入した結果、分裂死を引き起こすと考えられる。しかし、M期において細胞死に至る分子メカニズムは不明である。本研究は、DNA損傷を受けたがん細胞がM期に進入後に分裂死に至るメカニズムの解明を第一の目的とした。そこで、DNA損傷を経ず直接スピンドルチェックポイントを活性化し、分裂死を誘導する薬剤monastrolをスクリーニングに用い、今年度はshRNAライブラリーを用いた分裂死誘導遺伝子の同定を試みた。
ヒト全遺伝子に対するshRNA発現レンチウイルスライブラリーをHeLa細胞に感染させ、shRNA発現細胞を樹立した。本研究で標的とする遺伝子群は分裂死誘導遺伝子であるから、shRNAの発現によって抑制されても細胞の増殖には影響を与えないことが予想されたため、shRNA発現細胞の樹立には十分な期間の薬剤選択を行った。HeLa細胞はmonastrol感受性であり分裂死に至るが、shRNAによって分裂死誘導遺伝子が抑制された細胞は、monastrol耐性を獲得して生存しコロニーを形成することが期待される。ヒト全遺伝子に対するshRNAを発現するHeLa細胞にmonastrolを処理して培養を続けたところ、HeLa細胞をM期で完全に死滅させる200μMではmonastrol耐性コロニーを得ることができなかった。そこで様々な濃度のmonastrolをコントロール及びshRNA発現細胞に処理して、コントロール細胞が死滅してshRNA発現細胞は生存してコロニーを形成する濃度の検討を行った結果、長期間暴露した場合にmonastrol耐性のコロニーを形成する濃度を決定することができた。
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