| 研究課題/領域番号 |
20590200
|
|---|
| 研究機関 | 日本医科大学 |
|---|
研究代表者 |
石橋 宰 日本医科大学, 医学部, 講師 (70293214)
|
|---|
| 研究分担者 |
瀧澤 俊広 日本医科大学, 大学院・医学研究科, 教授 (90271220)
|
|---|
| キーワード | マイクロRNA / exosome / Processing body / GW182 / バイオイメージング / CD-63 / 蛍光蛋白質 |
|---|
| 研究概要 |
本課題の当該年度における到達目標は、細胞外に放出される微小小胞であるexosome、およびマイクロRNA (miRNA)による標的遺伝子サイレンシングの現場と考えられているprocessing body(P-body)を分離し、それぞれに含まれるmiRNAについてプロファイリングを行った後、両者を比較検討することである。最近、我々は、exosomeの分子マーカーの1つであるCD63に対する抗体を用いた免疫沈降法により、細胞培養上清中のexosomeを効率的に濃縮する方法を確立した(Luo et al. Biology of Reproduction投稿中)。現在、本課題で使用予定のMC/9およびHepG2の両細胞株においても、同様の手法が適用かどうかを検討中である。一方、P-bodyの分離については、それに局在する代表的蛋白質分子であるGW182に着目し、これに対する抗体(ウサギポリクローナル抗体)を作製した。これまでに、ELISAおよびウェスタンブロッティングにおいて、本抗体がヒトGWI82を特異的に認識することを確認しており、現在、免疫沈降法によるP-bodyの分離についてその条件検討を行っているところである。
一方、次年度の研究計画であるバイオイメージング技術を用いた成熟型miRNAの動態の分子解剖学的解析の準備として、ヒトCD63とヒトGW182を蛍光蛋白質(GFPやDsRed)との融合蛋白質の形で発現させるためのベクターを構築し、Cos7細胞等で一過性に発現させることにより、これらが実際に細胞内で機能しうることを確認した。今後、これらの安定的発現細胞株の作製を進めている。
|
