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A)白血球-血管内皮細胞の相互作用に関わる細胞接着因子のcDNAクローニング
(1)ヒト臍帯由来血管内皮細胞HUVECより調製したRNAを鋳型にしてRT-PCRおよびPCRを行い、タイト・ジャンクションに局在する膜タンパク質Junctional Adhesion Molecule (JAM)ファミリー(JAM1/2/3)およびOccludin/Claudin5のcDNAをクローニングし、得られたcDNAの塩基配列の確認を行った。
B)リアルタイム蛍光分子イメージング用発現ベクターの構築および発現確認
(1)上記A)でクローニングしたcDNAを緑色蛍光タンパク質GFPタグを有する発現ベクターに組み込み、293T細胞に遺伝子導入して、抗GFP抗体を用いて各々の全細胞タンパク質抽出液をウエスタン・ブロット法により解析した。その結果、GFP融合Junctional Adhesion Molecule (JAM)ファミリー(JAM1/2/3)およびOccludin/Claudin5は、cDNAから予想される分子量のポリペプチド鎖として発現していることが確認された。(2)血管内皮細胞に上記(1)で構築した発現ベクターを導入して、GFP融合タンパク質の局在を検討した結果、適度のGFP融合タンパク質が発現した場合に、血管内皮細胞間接着部位に濃縮したGFPのシグナルが検出され、各抗体を用いた間接免疫染色法で認められる、各膜タンパク質の本来の局在と一致することが明らかになった。
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