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JunBプロモーターの単離とレポーターコンストラクトの作製
PBMCよりDNAを抽出し、human JunB染色体遺伝子のプロモーター領域をgenomic PCR法を用いて増幅、クローニングした。増幅産物は塩基配列をシークエンスの後、レポーターに組み込み解析の準備が出来た。上記コンストラクトよりプロモーターのdeletion mutantをPCR法により作成した。JunBプロモーターのdeletion mutantはあらかじめ解析しておいた既存の転写因子のマップを参考として作成した。作製したレポーターコンストラクトを順次H-RS細胞株、ALCL細胞株に導入し、dual luciferase assay法によりJunBプロモーター活性誘導に重要な領域シスエレメントを特定する予定である。
CD30過剰発現Tリンパ腫にNPM-ALKを導入してALCL様特徴が誘導された時、すなわちNF-kBからALKにシグナルが変換する際の生じるシグナルの変化
CD30過剰発現Tリンパ腫T-HL、ALCLにレトロウイルスに組み込んだNPM-ALKあるいはそのコントロールとして空ベクターを感染させ導入、ピユーロマイシンによりセレクションした。セレクションした細胞は各5x10^6を用いてそれぞれNPM-ALK導入細胞とそのコントロール(空ベクターを導入したもの)という組み合わせでプロテオミクスの系にて解析した。解析はProQおよびSYPROによるリン酸化状態の変化、蛋白質発現量の変化の検討により行った。T-HLとしてL540、HDLM2をALCLとしてMac1、Mac2Aを用いた。タンパク質の発現量、あるいはリン酸化の変化を指標にして解析をすすめ、リン酸化状態の変化の検討により行い、約20の候補タンパク質を得た。
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