| 研究課題/領域番号 |
20590448
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| 研究機関 | 香川大学 |
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研究代表者 |
宮田 茂 香川大学, 医学部, 講師 (90314913)
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| 研究分担者 |
成谷 宏文 香川大学, 医学部, 助教 (30452668)
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| キーワード | ウェルシュ菌 / イプシロン毒素 / bent DNA / プロモーター / コラゲナーゼ / フェレドキシン / NagH / AT-rich遺伝子 |
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| 研究概要 |
連続したアデニン塩基が周期的に存在(phased A-tracts)すると、折れ曲がりDNA(bent DNA)を形成する。ウェルシュ菌を用いてプロモーター周辺領域に存在するbent DNAの転写における役割を解析するため、3種類のbending promoter(α毒素、フェレドキシン、ε毒素)の転写量を25℃と37℃の条件下で調べたところ、α毒素は25℃で、ε毒素は37℃で、フェレドキシンは温度に関係なく高い転写活性を示した。ε毒素プロモーターについてさらに詳細に調べるために、プロモーター選択ベクターpPSVヘクローニングを試みたが、bent DNA領域内に常に変異が生じたため、現在新規プラスミド及びレポーター・システムを構築している。
また、Clostridium属細菌の遺伝子は、極端にAT含量が高く、rare codonのtRNAを補充した大腸菌CodonPlus RIL等を用いても全長を発現させることは困難である。そこで、これらbending promoterを用いた発現系の構築を試みた。広い温度範囲にわたり高い転写活性をもつフェレドキシン・プロモーターを大腸菌・ウェルシュ菌シャトルベクターに挿入し、その下流にmultiple cloning siteと(His)_6-tag coding sequenceを挿入したAT-rich遺伝子発現用プラスミドを作製した。このプラスミドにC. histolyticumの116-kDaコラゲナーゼ遺伝子(colH)や180-kDaタンパク質をコードするC.perfringensのnagH遺伝子を挿入し、主要な菌体外プロテアーゼであるclostripain-like proteaseをノックアウトしたC. perfringens13Clp^-を形質転換した。両タンパク質とも発現量が高く、容易に精製することができた。精製したコラゲナーゼは市販品より純度が高く、移植医療用細胞の分離等の応用が期待できる。また、今までビアルロニダーゼ(μ-toxin)とされてきたNagHにはヒアルロニダーゼ活性はなく、O-GlcNAcase活性をもつN-acetyl-β-D-glucosaminidaseであることが明らかとなった。
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