| 研究概要 |
平成20年度は分子タグを融合したAktを、トロンボポエチン依存性の巨核球系細胞株に安定発現させた細胞株UT-7/TPO/Akt-Strepを作製し、トロンボポエチン刺激によってこの細胞内のAktと相互作用する分子群をタグを目印にしてカラム生成により分離した後に、この分子群をMALDI-TOF型質量分析計を用いて同定するという行程を実施したが、この方法では良質な質量分析のピークを得ることができず、Aktと相互作用する蛋白の同定には至らなかった。この原因として、カラム精製して得られた分子群の蛋白の絶対量が過小であったこと、もしくは同定に用いたMALDI-TOF型質量分析計の感度が当初の期待ほど高くはなかったことなどが考えられた。このため平成21年度は行程を一部変更し、通常の巨核球系細胞株UT-7/TPOをトロンボポエチンで刺激した後、Aktに対する市販のモノクローナル抗体を用いて免疫沈降し、得られた蛋白を脱塩するためにアクリルアミドゲルに電気泳動した後にこのゲルを銀染色した。蛋白を示すバンドを切り出した後にゲル内消化することで得られた蛋白を、最新型のLC-MS(QSTAR[○!R] Elite LC/MS/MS System, Applied Biosystem社)にて解析した。これによりトロンボポエチン刺激によりUT-7/TPO内でAktと新たに結合する、もしくはAktの蛋白複合体から離脱する分子を複数個同定することが可能となった。同定された蛋白の中には現在までAktと相互作用することが報告されていないものもいくつか含まれている。今後は得られた蛋白のそれぞれを細胞内でノックダウンなどを行うことなどによりその機能を詳細に解析し、トロンボポエチンシグナリングにおけるそれぞれの分子の役割を解明する予定としている。
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