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1.ヒト変異および正常ウロモジュリン遺伝子トランスジェニックマウスの作成。
(1)導入遺伝子断片の作成:ヒトウロモジュリンcDNAとマウスウロモジュリン遺伝子プロモーターDNAとをそれぞれPCRクローニングを行い、正常ヒトウロモジュリンcDNAまたはC148Wとなるように変異を導入したヒトウロモジュリンcDNAをマウスウロモジュリン遺伝子プロモーター配列下流に連結した導入遺伝子断片を作成した。
(2)トランスジェニックマウスの作出と選別:導入遺伝子断片の受精卵インジェクションを外注し、得られたマウスの遺伝子型を解析して遺伝子導入を確認した。導入遺伝子が仔に伝達するのを確認後、腎臓でヒトウロモジュリンの発現量の最も多い系統をそれぞれ選別した。
(3)トランスジェニックマウス系統の繁殖維持:ヒト変異および正常ウロモジュリン遺伝子トランスジェニックマウスをそれぞれヘテロ体として維持繁殖を行っている。
2.腎内ウロモジュリン蛋白蓄積の検討
(1)ウロモジュリン蛋白発現レベルの定量的解析:western blottingにより解析したところ、ヒト正常ウロモジュリンとヒト変異ウロモジュリンは分子量が異なり発現量が比較できなかった。変異ウロモジュリン導入マウスでは低分子量のマウスウロモジュリンの蓄積が増加していたが、正常ウロモジュリン導入マウスでは蓄積が認められなかった。
(2)糖鎖構造の解析:ヒト変異ウロモジュリンはEndo H感受性、ヒト正常ウロモジュリンはEndo H抵抗性であり、変異ウロモジュリンには糖鎖修飾不全が認められた。
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