| 研究課題/領域番号 |
20591079
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
塚本 和久 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (20251233)
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| 研究分担者 |
磯尾 直之 東京大学, 医科学研究所, 助教 (80420214)
森屋 恭爾 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (00272550)
藤江 肇 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (90332577)
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| キーワード | ステロリン / NPC1L1 / spheroid HepG2細胞 / ABCG5 / ABCG8 |
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| 研究概要 |
肝臓からのコレステロール排泄機構の全貌は未だ明らかにはなっていない。我々は、肝臓では小腸と異なるABCG5遺伝子(ステロリン1)が存在することを見出し(未発表データ)、この遺伝子の役割および細胞内動態を追求するとともに、既報のステロール排泄に関与する分子の細胞内動態の研究、および可能ならば新たなトランスポーターの発見を本研究にて目指す。
平成20年度は、肝臓特異的ABCG5遺伝子およびNPC1L1遺伝子のクローニングとこれら遺伝子を含有するアデノウイルスの作成、ABCG8遺伝子含有アデノウイルスの作成、およびin vitroで用いる細胞系spheroid HepG2細胞(以下、sHep細胞)の確立とその検証を行った。昨年度提出した報告書に記載したとおり、平成20年度末までにsHep細胞の確立と、通常培養HepG2細胞と比較してのsHep細胞の脂質代謝を検討する上での有用性を確認し、ABCG5遺伝子およびNPC1L1遺伝子のクローニングは終了していたが、各遺伝子発現ウイルス、およびこれら対象遺伝子とGFPなどとの融合蛋白を発現を可能とするウイルス作成するも十分に目的蛋白発現を確認できなかったため、平成20年度研究費の繰越を行い以下の研究を行った。まず、ABCG5およびABCG8遺伝子の上流部に新たにコザック配列を挿入することにより、目的とするステロリン蛋白の発現をWestern blotで十分に確認できるように改良に成功した。また、レポーター蛋白とステロリン蛋白との融合蛋白遺伝子改変においても、目的遺伝子とレポーター遺伝子との接合配列を改変することにより、細胞内でレポーター蛋白の発現を蛍光顕微鏡で確認できるように改良できた。これにより、平成21年度の研究隊行につながった。
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