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1.ROD1がスプライシング制御する遺伝子の同定
ROD1のGST fusion proteinを作成し、SELEX法により、ROD1と特異的に結合するRNA結合配列がG(G/U)(G/U)Gであることを同定した。以前からの報告で、ROD1はGGG配列とUUU配列それぞれへの結合性が示されているので、総合すると、ROD1はG/U tractへの結合性があることが推測された。
ROD1の生理的役割を解析するため、我々はsplicing制御に注目して解析を行った。まず、SELEX法で同定されたROD1結合配列が、splice site近傍に出現しており、かつ、alternative splicingをうけるexonをHuman genomeよりbioinformaticsにより抽出した。PTBP1、LRDD、CLEC10A、HISPPD2Aをはじめとする20個ほどの候補遺伝子exonが抽出された。次に、これらexonのminigeneを作成し、rt-PCR法によりROD1の過剰発現、knock downに対するsplicing patternの変化を観察した。しかし、残念なことにROD1発現変化に対する反応性は認められなかった。
これは、SELEXで得られた結合配列がGUtractという比較的出現頻度の高いmotifであり、この配列の出現部位が必ずしもROD1結合部位ではないためと考察された。再度SELEX法を行ったが、同様の結果が得られた。ROD1の結合部位同定には、in vitroでなくin vivoで結合部位情報を得る、CLIP法に挑戦する必要があると考察された。
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