| 研究概要 |
申請者らは、血液脳関門を形成する脳毛細血管内皮細胞およびアストロサイトを安定して供給するために、これら細胞の初代培養細胞に遺伝子導入し、長期培養可能な細胞株を得ることを昨年度に引き続き行った。マウスの脳から脳毛細血管内皮細胞を初代培養し、SV40T抗原cDNAを含むベクターを遺伝子導入し、抗生剤(Zeocin, Blasticidin)にてセレクションを行い、3個のクローンを得た。一方、アストロサイトに関しては、ラット胎児(E18)の大脳皮質から初代培養し、脳毛細血管内皮細胞と同様に、SV40T抗原cDNAを含むベクターを遺伝子導入し、抗生剤にてセレクションを行い、10個のクローンを得た。これらの13個のクローンは、全てテトラサイクリンにて遺伝子発現がコントロール出来るTet-onシステムのベクターを用いたが、テトラサイクリンを除去した場合にSV40T抗原の発現低下が観察されなかったため、これらのクローンに、再度、Tet repressorを発現するベクターを遺伝子導入した。再び細胞株をセレクションし、ウエスタンブロットで確認したところ、テトラサイクリンを除去した場合にSV40T抗原の発現が消失するクローンを得ることが出来た。現在、SV40T抗原のON/0FFにより、細胞株の性質(脳毛細血管内皮細胞やアストロサイト特異的タンパクの発現など)が、どのように変化するか、RT-PCRおよびウエスタンブロットにて確認を行っている。
一方、昨年度に引き続き、血液脳関門機能に関係すると思われるNOの産生について、ラット胎児(E18)の大脳皮質から初代培養したアストロサイトに、各種炎症性サイトカインを作用させ検討を行った。細胞内シグナルを検討したところ、NF-κB経由でのシグナルが重要であることが判明した。今後、NOの産生が、血液脳関門機能にどのような影響を与えるか、検討を行う予定である。
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