| 研究概要 |
1. IL-12遺伝子発現プラスミドの精製:2ヶ所の発現領域(EcoR1, BamHI)を有するpCAGGSにそれぞれ1008bpのマウスIL-12 p40 cDNAと1260bpのIL-12 p35 cDNAを挿入したプラスミドが当科にて実験系にて使用され、その効果が確認されている。このプラスミドを用いE. coli JM109 competent cellを形質転換し、LB培地にて大量培養後、QIAGEN Mega kitを用いプラスミドを精製・回収し、その純度(O.D. 260/280)が1.9以上である事を確認した。さらに、HindIII、EcoR1にて酵素処理後、アガロールゲルにて電気泳動し、目的とするプラスミドが得られている事を確認した。
2. PLL-g-HAの精製:共同研究施設である、九州大学先導物質科学研究所丸山研究室にて精製。高分子ヒアルロン酸をヒアルロニダーゼを用いて切断し、低分子ヒアルロン酸を得た。水酸化シアノほう素ナトリウム(NaBH_3CN)を還元剤とし、0.1M pH8.0のホウ酸ナトリウムバッファー内にてヒアルロン酸(HA)とポリ-L-リシン(PLL)の重合反応を行い、恒温撹拌槽(40度)にて5日間処理した後、限外濾過(MWCO:25000)にて重合できなかったピアルロン酸を取り除いた。さらに凍結乾燥にてPLL-graft-HAの粉末を得た。
3. PLL-g-HAとpCAGGS-mIL12の重合確認:1M NaCl 10mM PBS(-)(ph=7.4)に溶解したプラスミドDNAに、同バッファーに溶解したPLL-g-HAをN/P比=0,0.5, 1, 2, 3, 4, 5となるように加え、1時間室温にてインキュベーションした後、NaCl濃度が137mMとなるようにリン酸緩衝液(ph=7.4)を加えて希釈。更に30分間のインキュベーションを行い重合反応とした。アガロースゲルにて電気泳動し、プラスミドのバンド消失をもって重合の確認とした。N/P比=0.5よりバンドの消失が認められ、N/P比=3にて完全なるバンドの消失を認めた。
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