| 研究課題/領域番号 |
20591610
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
安近 健太郎 京都大学, 医学研究科, 助教 (00378895)
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| 研究分担者 |
猪飼 伊和夫 京都大学, 医学研究科, 准教授 (60263084)
上本 伸二 京都大学, 医学研究科, 教授 (40252449)
石井 隆道 京都大学, 再生医科学研究所, 研究員 (70456789)
加茂 直子 京都大学, 医学研究科, 医員 (50452355)
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| キーワード | 肝幹細胞 / 表面抗原 |
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| 研究概要 |
マウス肝幹細胞特異的遺伝子候補の選別
1)マウス肝前駆/幹細胞分画の分離。
我々が上記の先行研究においてすでに確立した方法に基づき、全身にgreen fluorescent protein(GFP)を発現する遺伝子改変マウスより蛍光励起セルソーター(FACS Vantage SE)を利用して、マウス成体肝臓由来肝前駆/幹細胞分画を分離した。また、同時に成熟肝細胞分画を分離し、同一個体より肝前駆/幹細胞分画と成熟肝細胞分画とを分離した。
2)肝幹細胞特異的発現遺伝子のスクリーニング
上記のようにして同一個体より分離した肝前駆/幹細胞分画と成熟肝細胞分画のそれぞれよりmRNAを抽出し、cDNAライブラリーを作製したうえで、DNAサブトラクション解析を施行し、肝前駆/幹細胞分画に特異的に発現する36個の遺伝子候補を選別した(一次スクリーニング)。選別した候補遺伝子の中から蛍光励起セルソーターによる細胞分離に利用可能な細胞表面抗原遺伝子に焦点を絞り、genome infomaticsの情報を利用して、膜貫通ドメインを持つ24個の候補遺伝子をさらに選び出した。その上で、各候補遺伝子に対してPCR primerを設定し、改めて分離した肝前駆/幹細胞細胞分画に対してRT-PCRを行い、実際に遺伝子発現を確認した(二次スクリーニング)。さらに、肝前駆/幹細胞分画より発現蛋白質を抽出し、二次元電気泳動により発現遺伝子のタンパク発現を確認する(三次スクリーニング)。こうして肝幹細胞特異的発現遺伝子候補を6個に絞り込んだ。
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