| 研究概要 |
全身麻酔下に12週齢日本白色家兎の大腿骨および脛骨骨髄より骨髄液10mlを採取した、採取した骨髄液を10%FBSおよび抗生物質を添加したDMEM培地を用いて単層培養し,ディッシュに付着した細胞を骨髄間葉系幹細胞(MSC)として回収した.
回収したMSCを引き続き単層培養にて継代したのち軟骨分化誘導を行った.具体的には,MSCを3.0×10^5個/tubeの量で15mlサイズのエッペンチューブへ分注し,間葉系幹細胞軟骨分化培地DF-C(TMセルリサーチ社)を1ml/tube毎入れ,500G5minで遠心をかけペレットを作成し,これを37℃,5%CO_2インキュベーター内で3週間ペレット培養を行った.培養3週間後のペレットに対してサフラニンO染色を行ったところ,良好な軟骨基質を認めた.また,PCRによりII型コラーゲン,アグリカンの発現を確認し,良好な軟骨分化能があることを確認した.
現在は,B&D社Wnt5a精製蛋白をMSC培養液中に添加することにより,軟骨分化能に差を認めるか否か検討中である.添加するWnt5a精製蛋白量(25ng/ml,50ng/ml,100ng/ml,200ng/ml,時期(0日〜,5日〜,10日〜),期間(5日,10日,20日)などを変化させ,刺激の有無により各マーカー(Type II collagen, Type I collagen, Sox-9, β-catenin)の変化をWestern blot, Alcian blue染色,RT-PCRにより評価する予定である.
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