| 研究概要 |
NPYの細胞レベルでの血管内皮細胞透過性亢進作用を、内皮細胞の単層培養を展開し、Transendothelial FITC-labeled albumin permeabilityの測定からNPYの血管透過性亢進作用を検討する目的で実験を行った。
正常ヒト肺動脈内皮細胞(Normal Human Pulmonary Artery Endothelial Cells : HPAEC)を用いて、細胞数:約2×10^5個/8ml/10cmシャーレとなるよう細胞を起こした。インキュベーター内で培養(37度, CO_2 5%)の後、事前に継代用のインターセルを24穴プレートにセットし、セル内にコラーゲンタイプIV50μlをコーティングし、2-3日乾燥させておいて、1週間後細胞が十分に増殖した後、細胞数カウントし、継代(細胞数:約4×10^5個/400μl/インターセル)になるよう調整した。インキュベーター内で培養(37度, CO_2 5%)し、2週間後に薬剤添加し,Alb透過性測定を行った。
添加薬剤としてNeuropeptide Y (略称:NPY) (Human, Rat, Mouse)を用い、測定試薬としてAlbumin,標識Albumin、NPY原液を超純水で段階希釈し、異なる濃度の希釈液を作成(原液:200μg/ml,希釈液濃度:10^<-3>/10^<-2>/10^<-1>/1/10μg/ml)して用いた。
測定法:インターセル内の培養液を除去し、1%の標識Alb 270μlをセル内に添加の後、1%のAlb 1000μlをセル外に添加、コントロール用の超純水,NPY希釈液30μlを各々上槽に添加、インキュベーター内で60分間透過さた後、セル外の液を100μlとり、5倍に超純水で希釈し、上記溶液を96穴プレートに200μlずつ注入した。蛍光プレートリーダーにて標識Alb吸光度を波長492nmで測定し、NPYを加えない時の透過性を100%として、薬液注入時の透過性を%で表示した。
研究結果:NPY濃度10段階(0, 10^<-7>, 10^<-6>, 10^<-5>, 10^<-4>, 10^<-3>, 10^<-2>, 10^<-1>, 1, 10pg/ml)に対する透過性はそれぞれ(100, 101, 102, 169, 173, 163, 172, 220, 229, 226%)であた。この結果から、NPYは、ヒト肺血管内皮細胞の透過性を濃度依存性に亢進させることが判明した。
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