研究課題
これまでの自家骨髄幹細胞移植による膀胱再生研究では実験動物としてマウスを使用しており、ICR雄マウスの骨髄幹細胞を採取して、BALB/C nu/nu雌nudeマウスに移植するという同種移植による実験手法であった。そのため、本年度はマウスよりもやや大型のラットもしくはラビットを使用して、同一個体での移植を試みた。ラット、ラビットの大腿骨骨髄より注射針で骨髄由来幹細胞を採取し15% fetal bovine血清および抗生剤附加のDulberco Modified Eagle Mediumの中に入れる。細胞を遠心分離した後に、Type I collagenでコートした培養皿で7日間培養した。ラットでは、十分な培養は不能であったが、ラビットにおいては成功した。培養途中の5日目の時点で、Lipofectamine 2000 Reagentを使用し、GFP(Green fluorescence protein)発現遺伝子を培養細胞内にトランスフェクションしてマーキングした。漿膜側より-80℃のアイスバーで障害を受けた膀胱モデルへ、30G注射針を使用して膀胱壁に培養した細胞1×10^5個/50μlを移植した。移植後3日目、14日目に膀胱を取り出し、Monoclonal anti-GFP抗体、平滑筋特異抗体を使用して免疫二重染色を行い、レーザー蛍光顕微鏡で移植した細胞の分化、つまり、筋層をはじめとする膀胱の再生を確認した。14日目の膀胱においては、Acta2 primerを使用してalpha smooth muscle actinを、Myhll primerを使用してsmooth muscle myosin heavy chainを、Real time RT-PCR法にて定量測定し、骨髄幹細胞の膀胱平滑筋への分化についての評価を定量的に行うことも可能であった。
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