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H20年度において正常マウス角膜上皮細胞を10継代以上安定して培養することに成功し、本方法においてマウス角膜上皮細胞がその特徴を維持していることの確認をおこなった。H21年度においてはさらに、本研究の主目的である培養マウス表皮細胞から角膜上皮様細胞への形質転換を試みた。
表皮細胞から角膜上皮への形質転換を確認するため、角膜特異的分化マーカーであるケラチン12(K12)の発現(プロモーター)によりGFPを発現するK12-Cre-ZEGマウスを用いた。K12-Cre-ZEGマウスより分離したマウス表皮細胞を、無血清培地で培養した。我々は、角膜上皮の環境下で表皮細胞から角膜上皮細胞への形質転換が起こると考えており、培養マウス表皮細胞と野生型マウスより得た角膜上皮細胞を1:1で混和して培養した。その緩和した培養細胞を野生型マウスより摘出した角膜実質上または、プラスチック、羊膜上に播種し、Caを添加した無血清培地で培養を行った。4日間培養後、GFPの発現を蛍光顕微鏡で確認したところ角膜実質上に播種した細胞でK12-Cre-ZEGマウス由来のGFPの発現が認められ、これらGFP陽性細胞は角膜輪部に集中して存在した。一方で、GFPの発現はプラスチック上、羊膜上ではGFP陽性細胞は認められなかった。これらの結果より、培養マウス表皮細胞が、形質転換により、K12を発現する角膜上皮様細胞に分化したと考えられる。培養マウス表皮細胞は一定の条件下で、角膜上皮様細胞へ形質転換する可能性が示されたことより、H22年度には、より効果的な培養マウス表皮細胞から角膜上皮様細胞への形質転換の条件を検討する予定である。
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