| 研究課題/領域番号 |
20592235
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| 研究機関 | 昭和大学 |
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研究代表者 |
山田 嘉重 昭和大学, 歯学部, 講師 (40360127)
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| 研究分担者 |
増田 宜子 昭和大学, 歯学部, 講師 (10297038)
川中 岳雄 昭和大学, 歯学部, 助教 (10365702)
木下 潤一朗 昭和大学, 歯学部, 講師 (90360122)
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| キーワード | アメロジェニン / In situ PCRIn / LAMP / In situ LAMP / 免疫染色 |
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| 研究概要 |
エナメル質の主要構成成分であるアメロジェニンの遺伝子発現が、歯の形成初期の象牙芽細胞においても発現していることをIn situ PCR法において我々も確認した。しかし、発現が微量なこと、切片の損傷が著しいことより、今年度はIn situ LAMPという新しい遺伝子増幅法を応用して、発現の確認を行った。本方法は、温度の上昇と下降を繰り返すPCR法とは異なり、65度から70度前後の温度において遺伝子の増幅反応が行われるという方法で、組織切片の破壊が起こりにくいという利点が挙げられる。まず準備として以前に研究の指導を受けた、ミシガン大学のDr Simmer, Dr Huより提供を受けたアメロジェニンのcDNAを用いてLAMP法においてもアメロジェニン遺伝子の増幅が可能であるかを確認した。その結果、LAMP法においてもPCR法と同様以上の増幅反応が起こることを確認した。その後、組織切片上にて増幅を行うIn situ LAMPを施行した。方法としてはIn situ PCR法と同様にDIGを用いてアメロジェニン遺伝子が組織切片上で反応するかを判定した。結果としてエナメル芽細胞には著しい遺伝子反応が認められ、初期の基質形成期の象牙芽細胞にも遺伝子の陽性反応は認められたが、確実に断定できうる程度の発現は得られなかった。原因としてプライマーに問題がある可能性が考えられたために、その後新たな3パターンプライマーの設計を行い、それぞれの反応の検討を行っているところである。また、遺伝子発現だけではなく、タンパク質に対する増幅システムを用いて免疫組織染色における反応についても検討を始めた。
既存のエナメル芽細胞に対する反応は著しく向上した。象牙芽細胞にも陽性反応らしき反応が認められたが、同時にバックグランドも多く出現したため、現在抗体の希釈度の変更、ブロッキング液の検討を行っている。
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