| 研究概要 |
[目的]コレステロールおよびその前駆物質(C27sterol)がin vitroにおいて種々の機能性細胞の増殖・分化にどのような影響をもたらしているか,あるいはその組成比率がシグナル伝達におよぼす影響についてはほとんど解明されていない.したがって骨および軟骨細胞を使って,コレステロール合成経路の動態変化を研究することは極めて意義深い。そこで本研究では、骨および軟骨細胞の増殖・分化におけるステロール類(コレステロール合成経路における中間代謝物:C27Sterols)が及ぼす影響について検討し,先天性コレステロール合成異常による多発奇形症候群およびSHH-patched系シグナル異常による顎・顔面奇形の病因メカニズムの解明と骨・軟骨疾患の診断および治療法の開発を目的として以下の研究を行った。
[方法と結果]マウス軟骨前駆細胞の初期および後期分化期におけるコレステロールおよびその前物質(C27sterol)の影響を、軟骨細胞への多段階分化が再現可能なマウス軟骨前駆細胞株ATDC5を用いて検討した。また、ATDC5細胞に種々の濃度のC27sterolを添加し増殖・分化維持が可能となるC27sterol濃度を検討し,培養9, 15, 21, 35日目にALP活性の定量およびトルイジンブルー染色を行い,骨・軟骨分化の程度を比較検討した。同様に培養を行った試料から各ステージのtotalRNAの抽出を行い,種々の軟骨分化マーカーの発現の差異、さらに、分化過程におけるC30ステロールであるラノステロールからC27ステロールであるコレステロールまでの代謝過程に関与する、C14デメチラーゼ、3-ケトリダクターゼ、C4デメチラーゼなどの発現変動について検討した。さらに、軟骨および骨分化に及ぼすSonic hedgehog (SHH), EGF, FGF-1, -2, wnt, insulin, transferrin,などの細胞増殖因子の細胞増殖および細胞分化に及ぼす影響を無血清培養系を用いて検討した。また、各種増殖因子受容体の発現についても、ウエスタンブロット法および定量PCR法を用いて検討した。
[結果と考察]軟骨分化過程をin vitroで再現可能なマウス軟骨前駆細胞株ATDC5を用いて,C27sterolの増殖・分化への影響について検討した結果、コレステロールおよびその前駆物質を外来性に添加することでマウス軟骨前駆細胞の増殖・分化に差異がみられることが明らかとなり、コレステロールおよびその前駆物質(C27sterol)がin vitroにおいて軟骨細胞の増殖・分化に重要な機能を有していることが明らかとなった。
|
