|
最近我々はシトシンバルジに特異的に結合し、特徴的な蛍光を発する低分子リガンド(DANP)を発見した。本研究では、我々が開発したDANPを用いることにより非共有結合で蛍光分子をDNA上に化学修飾したプライマーを用いた画期的なSNP(Single Nucleotide Polymorphisms)タイピング法の開発を行うことを目的とした。
シトシンバルジヘアピンプライマーの設計とPCRによる蛍光強度変化の実証
(1)シトシンバルジヘアピンプライマーの設計
我々は以前にシトシンバルジ構造にDANPが結合した際の電子スペクトルの特徴についての予備実験を行っている。
この予備実験を基に、シトシンバルジ周辺の塩基配列を検討し、バックグランド蛍光と有効シグナルのS/N比が最大になるような配列について検討した結果、シトシンバルジの隣接塩基がチミンであるA_A/TCT配列が最も適していることが明らかとなった。さらにシトシンバルジをヘアピン構造中に複数個存在させることにより蛍光強度の増大が観測できた。
(2)PCRによる蛍光強度変化の実証
(1)で最適化されたシーケンスを用いてPCR前後における蛍光強度変化の実証を行なった。方法としては、テンプレートとしてプラスミドを用い、市販のtaqポリメラーゼ、DANP、シトシンバルジヘアピンプライマーを使用してPCRを行なった後、PCR産物の電気泳動分析によりPCRの進行を確認するとともに、PCRの進行と蛍光強度変化の相関を確認したところ、PCRの進行に伴い蛍光強度が減少する良い相関関係が認められることが明らかになった。子の結果より、我々の開発した方法でPCRの進行をモニターできることが示唆された。
|
