| 研究概要 |
本研究におけるRNA光制御の原理では、KillerRedから光照射によって発生する活性酸素がそれら阻害タンパク質を不活性化することで翻訳を開始させる。阻害タンパク質の結合領域付近にKillerRedを近接させるために、KillerRedタンパク質両端にそれぞれPum1HDを融合させたプローブを作製した。実際に培養細胞ヘプローブベクターを導入し,その発現をImmunoblottingおよび蛍光観察にて確認した。次に、光照射によってKillerRedからROSが発生するかどうかを顕微鏡下で確認した。まず、ROSを専用の蛍光検出試薬で検出した結果、ROSの増加を示す指示蛍光色を示した。また、プローブ導入済の細胞に特定波長の光を照射した結果、大きくKillerRed赤色蛍光が減衰した。この蛍光は数時間放置すると回復することから、ROSが正常に発生しプローブタンパク質自身を不活性化したと推察される。
一連のプローブ機能を検査するためのレポーター遺伝子として、発光タンパク質ホタルルシフェラーゼ遺伝子配列を用いた。この遺伝子配列上流に、KillerRedプローブの結合領域となる特定のRNA配列を設計し連結した。RNA配列にRNA検出プローブが特異的に結合することを、免疫沈降法を用いて確認した。
mRNAからの翻訳を通常状態において抑制するために、特定の阻害タンパク質が結合して翻訳を抑制するよう、プローブ結合配列のさらに上流に阻害タンパク質結合配列を連結させた。遺伝子発現が抑制されることをルシフェラーゼの発光値を時間経過的に測定することにより確認した。今後光照射による翻訳誘導の最適化を検証する。
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