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研究代表者はDNAデータベースの遺伝子情報から分泌性シグナル配列を指標にして、ヒト、マウス、ゼブラフィッシュに共通して発現する新規な分泌性因子遺伝子を網羅的に探索した。さらに、新規な分泌性形態形成因子遺伝子の発見を目指した一次スクリーニングとして、ゼブラフィッシュを用いた遺伝子機能抑制実験により個体レベルで形態形成に異常を示す遺伝子を探索するとともに、その役割の分子メカニズムの解明を目指した。
1) ヒト、マウス、ゼブラフィッシュ分泌性因子遺伝子の探索
DNAデータベースにあるヒト、マウス、ゼブラフィッシュの機能不明な遺伝子がコードしていると期待されるアミノ酸配列を無作為に選択し、PSORT(a computer program for the prediction of protein localization sites in cells)などのアミノ酸配列ソフトを活用して新規な分泌性因子遺伝子を探索した。さらに、これらの遺伝子の内、遺伝子のhomology解析をして酵素遺伝子である可能性のある遺伝子は除くとともに、ヒト、マウス、ゼブラフィッシュに共通に発現している遺伝子を絞り込んだ。
2) ヒト、マウス、ゼブラフィッシュ分泌性因子遺伝子の単離
上記により同定された遺伝子が実際に発現しているかを確認するため、ヒト、マウス、ゼブラフィッシュcDNAを鋳型にし、PCRで遺伝子を増幅し、その遺伝子の配列を確認した。さらに、その増幅された遺伝子はベクターDNAを用いてクローニングした。
3) 分泌性因子遺伝子のマウス、ゼブラフィッシュ胎児期における発現の検討
様々な発達段階にあるマウス、ゼブラフィッシュ胎児における分泌性因子遺伝子の発現をwhole mount in situ hybridizationやsection in situ hybridization法により調べた。その発現様式から興味深い発現様式を示す遺伝子を絞り込んだ。
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