| 研究概要 |
Runx2は、骨芽細胞・軟骨細胞分化に重要な役割を果たしている。そして、Runx2の時間的・空間的発現および活性制御が、骨芽細胞・軟骨細胞分化および骨格形成・維持プログラムに必須である。EGFPとDsRedによりRunx2の発現と活性を同時に観察できるトランスジェニックマウスを作製し、その中足骨を用いた器官培養により、Runx2の発現と活性を調節できる化合物のスクリーニング系を確立することを目的とした。本年度は、Runx2プロモーター・EGFPトランスジェニックマウスを用い、BMP-2によるEGFPの発現上昇を検出する系を確立した。胎生15.5日および16.5日の中足骨を、BMP-2(0,20,80,320ng/ml)存在下で、12-36 時間培養した。培養後、蛍光実体顕微鏡で蛍光強度を観察したが、BMP-2濃度依存性に蛍光強度の増強を見た。この際、培養時間の最適化および骨の自家蛍光をできるだけ排除するためのフィルターの選定を行った。一方、培養後組織切片を作製、GFP抗体を用いた免疫組織染色を行った。GFP発現は骨芽細胞、軟骨細胞の両者で増強していた。さらに、定量解析を行うために、In Cell Analyzerを用いて、蛍光強度の測定を行った。BMP-2濃度依存性に蛍光強度の増強を見たが、さらに感度を上げるためには、フィルターの選定、使用レンズ、Z軸の設定、撮影ポイント、視野の指定、使用するプレート等、多くの検討課題も明確となった。これらは、今後、器官培養を用いて骨形成促進化合物のスクリーニングを行うための重要な基礎データとなった。
|
