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本研究課題では、MDM2-MDMX-p53複合体のストレス応答の分子機構を解析し、新規のp53のストレス応答機構を解明する事を目的としている。本年度の研究計画どおりに実施し、以下の研究成果を得た。
1) 大腸菌内で産生させたMDM2、MDMX、P53タンパク質の精製法の検討を行い、それらのタンパク質を用いて、高効率にユビキチン化反応を行うことが可能なin vitroユビキチン化アッセイ法の確立に成功した。
2) 確立したin vitroユビキチン化アッセイ法によって、ユビキチンE2酵素の同定を行い、ユビキチン化に必要な部位などを同定した。
3) p53のユビキチン化による制御機構を解析するため、ユビキチン化p53を用いた脱ユビキチン化酵素による脱ユビキチン化アッセイ法やプロテアソームを用いたプロテアソーム分解アッセイ法の確立を試みた。
4) Streptavidin-、Calmodulin-Binding Proteinを付加した、P53、MDMX、MDM2の遺伝子発現ベクターを構築し、それらを発現するMCF細胞を樹立した。
5) TAPシステムを用いてヒト培養細胞より、精製したMDM2-MDMX複合体を用いてのユビキチン化アッセイ法を樹立した。
6) MDM2、MDMXの発現量による電離放射線照射等によるストレス応答に対するp53の動態変化を解析した。
7) TAPシステムを用いてMDM2-MDMX複合体を精製、SDS-PAGE、染色を行い、得られたバンドを精製した。
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