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本研究課題では、MDM2-MDMX-p53複合体のストレス応答の分子機構を解析し、新規のp53のストレス応答機構を解明する事を目的としている。最終年度である本年度は、研究計画どおりに実施し、以下の研究成果を得た。
1) 本研究課題の初年度に開発したin vitro P53-MDM2-MDMXユビキチン化アッセイ法によって、P53、MDM2、MDMXのユビキチン化機構を解析し、新たなユビキチン化の分子メカニズムを解明した。また、新規のP53のユビキチン化修飾とその機構を同定し、それらのユビキチン化修飾によるストレス応答に対する細胞内でのP53の機能変化解析を行い、P53の新たな制御機構を見出した。
2) in vitroユビキチン化アッセイ法を用いて、P53-MDM2-MDMX複合体のユビキチン化やユビキチン化因子の分解や脱ユビキチン化に対する影響因子について解析し、それらの因子による影響の相違点を明らかにした。
3) TAPシステムを用いてMDM2-MDMX複合体を精製する事によって、複合体に相互作用する因子を分離し、質量分析によって同定した。培養細胞を用いて、同定した相互作用因子の遺伝子導入による過剰発現又はsiRNAによる発現抑制を行い、それらの因子がP53に与える影響及び機能解析を行い、P53の機能について新たな知見を得ることができた。
これらの結果から、放射線などの細胞に対するストレス応答機構における新たなP53の機能とMDM2-MDMX複合体によるユビキチン化メカニズムを介した新しい制御機構を見出した。
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