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本研究の目的は、申請者が独自に開発したIn vitro virus(IVV)法が汎用的なDNA結合転写因子探索ツールとして様々な転写因子が関与する標的遺伝子の新規な発現制御機構(カスケード)の解明に適用できることを証明することである。そのためにまず最初に、様々な転写因子を網羅し、かつ多様性と複雑性を兼ね備えたIVVライブラリーを構築した。次にこのIVVライブラリーを用いて、様々なモチーフ構造を持った転写因子が結合することが予想されるシスDNAエレメントを用いたモデルIVVスクリーニングを試みた。その結果、ヘリックスーループーヘリックス、ヘリックスーターン-ヘリックス、Znフィンガーモチーフを持った転写因子の選択に成功した。この結果を踏まえ、相互作用する因子の全貌が明らかになっていない細胞周期関連遺伝子のシスDNAエレメントを用いたIVVスクリーニングを行った。その結果、相互作用が未知の3種類の転写因子の選択に成功した。培養細胞を用いたプルダウンアッセイ、ゲルシフトアッセイなどの検証実験を行ったところ、選択された3種類の転写因子と細胞周期関連遺伝子のシスDNAエレメントは有意に相互作用していることがわかった。また現在、クロマチン免疫沈降法やルシフェラーゼアッセイ、選択された転写因子の強制発現による細胞周期関連遺伝子の遺伝子発現量の変化について検証しているところである。
以上より、本年度の研究計画にあったIVVライブラリーの構築、各種シスDNAエレメントと相互作用するタンパク質のスクリーニング、およびスクリーニングされた相互作用候補の検証実験は全て達成した。本結果は最終目標である新規なDNA-タンパク質相互作用を元に次々と上流の相互作用を提示することによる新規なカスケードの提案を達成する上で非常に重要な基盤データとなるものである。
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