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本研究の目的は、研究代表者が独自に開発したIn vitro virus(IVV)法が汎用的なDNA結合転写因子探索ツールとして様々な転写因子が関与する標的遺伝子の新規な発現制御機構(カスケード)の解明に適用できることを証明することである。前年度までに、相互作用する因子の全貌が明らかになっていない細胞周期関連遺伝子のシスDNAエレメントをベイトとしてIVVスクリーニングを行い、相互作用が未知の3種類の転写因子の選択に成功している。最初に、これらの転写因子がシスDNAエレメント内のどの塩基配列を認識しているのかについて検証すべく、ゲルシフトアッセイを行った。その結果、3因子のうち2因子については、他の転写因子が認識することが明らかになっている塩基配列を認識することが分かった。残りの1因子については配列特異性を見出すことはできなかった。次に、細胞内における前述の2因子と細胞周期関連遺伝子のシスDNAエレメントとの相互作用を検証すべく、クロマチン免疫沈実験を行った。その結果、2因子共に有意に相互作用していることが分かった。ルシフェラーゼアッセイの結果、2因子共に細胞周期関連遺伝子の発現の活性化に関与していることが分かった。さらに、細胞内において2因子を強制発現させて細胞周期関連遺伝子の発現量が変化するかどうかを見たところ、ルシフェラーゼアッセイの結果とは対照的に、発現量が低下していることが分かった。
以上より、IVV法を用いて既存の手法では得られない新規な相互作用を見出し、新しい生物学的知見を得ることに成功した。本研究の結果は、最終目標で掲げた新規なDNA-タンパク質相互作用を元に次々と上流の相互作用を提示することで新規なカスケードを解明することを進めていく上で非常に重要な基盤データとなるものである。
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