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本年度は、亜鉛フィンガーをはじめとするDNA結合タンパク質を利用した人工転写因子の創製と、それらを用いた細胞内での遺伝子制御に取り組んだ。具体的には、「DNA結合モチーフを利用したDNA結合スイッチの高機能化」として、代表的なDNA結合モチーフであるロイシンジッパーのヘリックス部分に化学的な修飾を施し、コバルトイオンに応答してDNA結合能がスイッチされる人工DNA結合タンパク質の創製に成功した。また、C2H2型亜鉛フィンガーモチーフの配位子を他のアミノ酸に置換した、配位子置換型フィンガーを作製した。天然型では亜鉛イオンとの結合親和性が高すぎるため、亜鉛イオン濃度依存的にDNA結合能をコントロールすることは困難であった。一方、配位子置換型フィンガーでは、亜鉛イオン濃度が高いときには天然型と同様のDNA結合能を示し、また金属キレーター存在下では、顕著なDNA結合力の低下が見られた。次に、「細胞内での遺伝子制御」に向けて、この配位子置換体に転写活性化ドメインを融合させた人工転写因子を細胞内で発現させた。標的結合DNA配列を含むレポーターベクターを用いて、転写活性化の亜鉛濃度依存性を検討したところ、作製した人工転写因子は亜鉛イオン濃度に依存した転写活性化能を示すことが明らかとなった。また、細胞内環境で作製した人工亜鉛フィンガーのDNA結合選択性を検討した結果、高い選択性を有することが明らかと成った。このような人工転写因子は、人工遺伝子回路の制御にとって、重要なツールとなると考えられる。
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