| 研究概要 |
申請者のグループで開発された人工塩基対システムを利用して、転写により種々の塩基類似体を位置選択的に組み込んだshRNAやsiRNAなどを培養細胞に導入し、その効果と機能を解析し、人工塩基が細胞内でどのように認識されるかを調べることを目的とし、その実験系を確立することによりさらなる新規機能性RNAの創出を目指す。
本年度は、研究実施計画の予定に沿って、転写により人工塩基を位置選択的に組み込んだshRNAの電気泳動による移動度の違いを利用した調製方法を確立すると同時に、ルシフェラーゼをレポーター遺伝子として培養細胞への遺伝子発現抑制効果を解析する系を立ち上げた。転写用の鋳型は、複数の人工塩基対(Ds-Pa、s-Pa, s'-Paなど)を利用できるように、Paを含むDNAをまずは使用している。一方、人工塩基が細胞内でどのように認識されているかを解析する指標として、また、shRNA中のどの位置に人工塩基を組み込むことが可能かを調べるために、shRNA中のさまざまな部位において、一塩基対のみ天然型塩基のミスマッチに変異させたshRNAバリアントも作成し、その効果を調べた。その結果、shRNAの中のある特定の領域では、ミスマッチの変異でも抑制効果が保持されている箇所があることを見出した。また、この効果がshRNAに一般的な現象なのかを調べるだめに、mRNA中でその他複数のターゲットサイトを選びだし、解析を進めている。またsiRNAでも同様の特性があるかを調べるために、人工塩基を位置選択的に組み込んだsiRNAを、shRNAから調製する方法などを検討中である。
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