| 研究概要 |
本研究では、α-アミノ酸のみならずα-ヒドロキシ酸(HA)を構成要素として用いることができるように拡張された遺伝暗号の翻訳系を、実用レベルまで改良・発展させることを目的とする。つまり、PylRSによるtRNA^<Pyl>へ付加できるHAの種類と、tRNA^<Pyl>が対応するコドンの種類を拡張することによって、効率よく複数個のHAを含む均一なポリマーを試験管内もしくは生細胞中で合成する技術基盤を確立することを目標としている。
本年度は, i) PylRSの基質側鎖部分の認識ポケットの改変体の作製による、使用可能な基質HAの種類の拡張、および、基質主鎖部分をα-ヒドロキシ基認識へ適応させることによる、酵素反応の効率化、ii) tRNA^<Pyl>のアンチコドンを改変および、内在性のaaRS・tRNAの除去によるセンスコドンヘのHAの対応付け、の2点について、様々なHAが効率よく導入される翻訳系を構築するための条件検討を行った。
その結果、新規にアミノ酸を認識せず、HAだけを特異的に認識する酵素変異体を作成することに成功した。その変異体を大腸菌で発現させると、野生型酵素に比べて効率よくHAが新生ポリペプチドに取り込まれる。変異箇所は側鎖認識に関わらないので、様々な側鎖に対するHAへ同じ変異を適用することができると考えられる。また、無細胞タンパク質合成系において、フェニルアラニンコドンのひとつであるTTCコドンヘのHA導入を判定できる系を作成した。内在性のaaRSを除去することなく、特異的な阻害剤によって不活性化することで、TTCコドンを「空白の」状態にすることができた。現在その系を用いて、HA特異的PylRS変異体を用いたHAのポリマー化を目指している。
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