| 研究概要 |
細胞膜近傍には「細胞の動き」に関連する重要なタンパク質が数多く存在すると考えられる.しかし,従来の分析法により,細胞膜界面に近接するタンパク質を同定することは難しい.そこで本申請研究ではこれまでの研究成果をもとに,細胞の内膜上および界面に存在するタンパク質を非破壊的に同定できる可視化プローブ開発を行った.具体的には,プロテインスプライシング反応を起こすタンパク質インテインと分割した蛍光タンパク質GFPを利用し,細胞膜界面に分析対象のタンパク質が近接すると全長GFPを形成する蛍光可視化プローブ分子を作製し,「細胞の動き」に関わるタンパク質の同定を目指した.
プローブのcDNA作製:GFPとインテインを用い,標的タンパク質が細胞膜近傍に局在してはじめて蛍光が回復する新規蛍光プローブを作製した。特定のアミノ酸残基で分割したGFPのN末にN末インテインと細胞膜局在シグナルペプチド(MLS)を連結した「N末プローブ」のcDNAを作製した.C末GFPにC末インテインとMLSを連結した「C末プローブ」のcDNAを作製した.また,C末プローブのMLSを,細胞膜近傍・細胞質・核に局在することが知られているタンパク質で置き換えたプローブのcDNAを作製した.
プローブを用いたタンパク質の同定法の確立:N末およびC末プローブをほ乳類細胞に発現させたところ,GFPの再構成に基づく蛍光の回復が観察された.また,N末プローブのMLSを細胞膜近傍に局在するタンパク質に置換したプローブおよびC末プローブを細胞に発現させたところ,蛍光の回復が確認された.一方,MLSを核局在タンパク質に置換したN末プローブおよびC末プローブを細胞に発現させたところ,微弱な蛍光の回復が観察された.本申請研究で開発したプローブ分子は,細胞膜近傍に局在するタンパク質を同定するツールとして有用であることいえる.
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