| 研究概要 |
本年度は親水性ポリスチレン(PS)高親和性ペプチドを連結した各種ヒトFoxP 3タンパク質を調製し, 本課題の目的である, スクリーニングシステム構築に必要な種々の相互作用解析を行った.
まず, 各種ヒト細胞のtotal RNAを鋳型としてOligodTプライマーを用いた逆転写PCRを行い, ターゲット遺伝子であるFOXP 3およびFOXP 2の各cDNAを得た. FoxP 3のDNA結合領域(Forkhead domain : FHD)を含む各種断片を調製した. さらに, 親水性PS高親和性ペプチド(RAFIASRRIRRP)を, 遺伝子工学的手法を用いて連結し, 各種タンパク質発現用ベクターを構築した. 各種大腸菌を宿主としてタンパク質発現を試みたところ, E. coli Rosetta 2(DE3)を用いた場合で可溶化することがわかった. さらに, 精製した可溶化タンパク質を用いたゲルシフトアッセイによりFHDのみを発現させたタンパク質がDNAとの複合体形成能を維持していることを確認した. さらに, 親水性PSプレートを用いて, 各種FOXPタンパク質とビオチン化二本鎖オリゴDNAとの特異的相互作用の解析をConventional ELISA法およびTwo step ELISA法により行った. その結果, あらかじめタンパク質とDNAを溶液中でインキュベーションした後に表面親和性ペプチドの特性を生かして高度選択的に固定化するTwo step ELISA法を用いることで, Conventional ELISA法に比べて非常に高感度な相互作用の検出が可能であることがわかった.
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