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申請者はアグロバクテリウム法で作出した組換えリンドウを解析する過程で、導入した35Sプロモーター領域のシトシン配列がメチル化されることにより、その転写が高頻度に抑制される現象を見出した。本研究では、この35Sプロモーター配列特異的にメチル化を引き起こす因子を同定し、発現抑制の誘導機構を明らかにすることを目的としている。本年度はメチル化誘導のターゲットとなる配列の存在を検討するために、(改変)35Sプロモーターがシングルコピーで導入された組換えリンドウについて、それらプロモーター領域のde novoメチル化についての詳細な解析を行った。
野生型35Sプロモーターを導入した組換えリンドウ系統について、35Sプロモーター領域に存在するCpHpH配列のメチル化頻度のみに着目して解析を行った結果、as-1エレメントの5' 側約80bpに存在する11個のシトシン配列に共通して高頻度なメチル化が認められた。このようなde novoメチル化のパターンは、as-配列に変異を導入した改変35Sプロモーターにおいても同様に観察された。このように、異なるゲノム上の位置にT-DNAが挿入されているにもかかわらず、一様なde novoメチル化パターンを示すという興味深い現象が示された。
また35Sプロモーターがシングルコピーで導入されたリンドウ培養細胞において、35Sプロモーター領域のDNAメチル化が認められない系統が見出された。この培養細胞とメチル化が認められる培養細胞系統について、35Sプロモーター領域におけるヒストン修飾をクロマチン免疫沈降法により比較した。その結果、DNAメチル化が認められない細胞ではヒストンH3のアセチル化レベルが上昇しており、逆に9番目のリジンのメチル化レベルは低下していた。
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