| 研究概要 |
本申請研究は糖質加水分解酵素の元来全く異なる2つの触媒機構であるアノマー保持型機構とアノマー反転型機構の相互変換を目的として行った。これは,アミノ酸配列ならびに構造類似性を持つが、一方はアノマー保持型,もう一方はアノマー反転型の触媒機構を有する酵素群が存在する,というところから発想を得たものである.2つの触媒機構の相互変換が可能になること有用糖の生産の効率化,バイオマスの低分子化の効率化を見込めると考えている.実際には前述のアノマー保持型,アノマー反転型の触媒機構の酵素を有する酵素群の触媒機構の相互変換を試みた。まず,アノマー保持型酵素の立体構造,触媒メカニズムに関する投稿論文を発表した.前年度までの研究で反転型酵素の塩基触媒基を取り除いたのちの求核触媒基の導入,保持型酵素の求核触媒基を除いたのちの塩基触媒基の導入,また触媒残基周辺残基の改変で,触媒活性を得られなかったため,さらに反応の遷移状態を安定化させるようなアミノ酸残基の導入,触媒残基近傍の"saturation mutagenesis"を行ったが触媒活性を有する変異酵素作製には至らなかった.本申請研究において,単純な触媒残基の置換,触媒残基周辺の置換で触媒活性を有する酵素を得られなかったことから,進化の過程のかなり早い段階で触媒残基の置換が起こることで,これら二つの触媒機構を有する酵素群は分岐しており,各々はさらに分子進化してきているものと考えることができる.また本申請研究に役立てるためアノマー反転型酵素の触媒過程におけるカルシウムイオンの必要性,カルシウムを失った酵素の立体構造解析,重水素ラベルした基質による触媒機構の解析を行った.また本申請研究と遠縁の関係にある酵素の触媒メカニズム,反応特異性について解析を行い報告した.
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