| 研究概要 |
細胞壁合成に関与するD-Ala-D-Alaリガーゼ(DDL)は, 抗生物質の一種D-サイクロセリン(DCS)により阻害される。しかしながら, DCS生産菌から取得したDDLは, DCSによって阻害を受けにくく, 自己耐性因子のひとつとして機能していた。本研究では, 本酵素のDCSに対する耐性メカニズムを原子レベルで明らかにするとともに, DCSをリード化合物とした新規の感染症治療薬の開発を試みる。DCS耐性DDLの三次元構造を明らかにするため, 本酵素の結晶化に取り組んだ。しかしながら, 本酵素の結晶化には成功しなかった。そこで, 人工的に作製した変異体の機能解析を行うことで, DCSとDDLの相互作用に関する情報を収集することとした。
DCS耐性DDLのアミノ酸配列と, DCS感受性DDLのアミノ酸配列とを比較すると, 活性中心近傍に存在するアミノ酸残基は両者の間で高度に保存されている。しかしながら, DCS感受性DDLの代表例である大腸菌由来DDLでは, 保存されたTyr210残基が2番目のD-Alaを収容するポケットに存在するものの, DCS耐性DDLにおける対応する残基はPhe246であった。このPhe246残基がDCS耐性に寄与しているとの仮説を立て, 本残基をTyrに置換した変異体を作製した。この変異体を発現する大腸菌株は, 野生型を発現している大腸菌株に比べDCS感受性になっていた。また, 変異体を精製し酵素学的パラメーターを求めたところ, D-Alaに対する親和性が著しく減少し, DCSに対する親和性はやや増加していることが明らかとなった。すなわち, 基質よりもDCSに対する親和性が高くなったため, 本変異体はDCS感受性になったものと考察される。
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