| 研究概要 |
リン酸化反応は蛋白質の代表的な翻訳後修飾の1つであり,蛋白質の機能,局在化,標的蛋白質への結合能などを調節している。生物はこの可逆的な反応を利用して,シグナル伝達,遺伝子発現,細胞周期の調節などを行っている。よって,蛋白質のリン酸化状態を知ることは疾患の治療や診断につながる可能性を持っている。そこで,当研究室ではリン酸化物をより特異的に認識する機能性低分子「フォスタグ」を開発した。フォスタグは低分子であるため,様々な既存のリン酸化物分離・分析法に適応できる。
フォスタグを用いた技術の1つにリン酸アフィニティー電気泳動法がある。通常の電気泳動ではリン酸基の有無による移動度の差がほとんどない。しかし,フォスタグを加えることで,リン酸基1つの違いでも分離することができる。更に,フォスタグは生体試料や低濃度の蛋白質にも適用できる。
本研究では,Mn^<2+>-Phos-tag SDS-PAGEを蛍光ディファレンシャル二次元電気泳動法に組み込むことにより,異なる環境におかれた細胞のリン酸化状態の違いを比較する方法を開発した。この方法では,リン酸化状態の異なる2種類のタンパク質群を,それぞれ異なる蛍光色素で標識した後,それらを混合したものを試料とする。まず,その試料を通常のSDS-PAGEで分子量別に分離した後,Mn^<2+>-Phos-tag SDS-PAGEで2次元展開する。同じ分子量のタンパク質でリン酸化状態(リン酸化数やリン酸化部位)が異なるタンパク質があると,2種類の蛍光色素に由来する像は重ならない。この方法により環境の違いによる細胞内の複数のタンパク質のリン酸化状態を一度に比較することができる。
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