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平成20年度は「骨芽細胞分化を促進する微生物培養液のスクリーニング」と「培養液のヒット検体からの活性化合物の単離・精製」を行なうとともに、「活性化合物の作用機序の解析」についても一部着手した。
スクリーニングでは、骨芽細胞の他、軟骨細胞や脂肪細胞などにも分化可能なマウス開業系細胞株C3HlOTl1/2を用い、骨芽細胞のマーカーであるアルカリフオスフアターゼ(ALP)活性を指標にした。研究代表者が所属する機関が保有する微生物培養液サンプルのうち、約1万5千サンプルについてアッセイを完了し、複数のヒット検体を得た。
ヒット検体からの活性化合物の単離・精製はスクリーニングと並行して順次行なった。まず、予備試験によって活性化合物の有機溶媒への溶解性を検討した。その後、吸着クロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を組み合わせて精製し、質量分析計や核磁気共鳴法により活性化合物の分子構造を決定した。これまでに新規化合物1種と、既知ではあるが骨芽細胞分化誘導活性が知られていない化合物1種を同定することができた。このことは、本課題で行なっているスクリーニング系は、微生物由来の低分子化合物の探索に適切な系であることを示している。
さらに、得られた活性化合物の作用機序の解析するために、骨芽細胞関連遺伝子の発現をリアルタイムPCRを用いて定量する系と、ゲノム網羅的に遺伝子発現を解析するDNAマイクロアレイ実験の立ち上げを行なった。
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