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本研究では、熱帯熱マラリア原虫prx遺伝子のcis-elementに特異的に結合するDNA結合因子(以下、「因子X」とする)を単離同定することを第一の目的とする。
本年度はまず原虫の核抽出物から因子Xを精製するための条件を決定した。具体的には、様々な種類のクロマトグラフィーの担体ビーズをバッチ法で原虫核抽出物に作用させ、その上清および、担体ビーズからの抽出両分に因子Xが含まれるかをゲルシフトアッセイによって確認した。その結果目的の精製に適した担体が明らかとなり、これを基に実際の精製条件を決定、精製をおこなった。33L(5×10^<11>細胞由来)の大量培養原虫核抽出物より陰イオン交換(Hi TrapQ)、陽イオン交換(Hi Tran CM)、疎水(RESOURCE Phenyl)、陽イオン交換(Mono S)の四段階のHPLCによる精製を経た後、DNAアフィニティービーズによる精製をおこなった。最終的に約30μLの活性のあるフラクションを得て、これをSDS-PAGEによって展開した。以前の予備実験の結果から、因子Xの分子量は55 - 66 kDaの範囲にあることがわかっているのでその範囲に注目したところ、因子Xの候補を3本のバンドに絞り込むことができた。これらのバンドを切り出し、受託LC-MS/MS解析にかけたところ、約20種類の原虫由来の因子X候補タンパクが同定された。同定されたタンパク群には唯一マラリア原虫で報告されている転写因子候補ファミリー(AP2 family)に属するタンパクは含まれていなかった。今後はこれら候補の組換えタンパクを作製しどのタンパクに真の因子Xの活性があるのかを解析する。今年度の研究の結果、因子Xの決定まであと一歩のところまで達しており、新規の原虫転写制御に関わる因子が同定できる可能性が見えてきたことは、非常に意義深いと考える。
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