| 研究概要 |
(1) siRNA抵抗性野生型SOD1発現ベクターの作製
マウスSOD1の中でsiRNAの標的部位となる塩基配列を, そのコドンよりコードされるアミノ酸は変えないように, 変換できる塩基をすべて置換し, siRNA抵抗性マウス野生型SOD1発現ベクターを作製した。
(2) siRNAとsiRNA抵抗性野生型SOD1の共導入ベクターの構築
先に作製したsiRNA抵抗性マウス野生型SOD1ベクターの上流に, 抗SOD1 siRNA発現ベクターのsiRNA転写ユニットを挿入して, 1つのベクター上にそれぞれ独自のプロモーター下にある抗SOD1 siRNAとsiRNA抵抗性マウス野生型SOD1 cDNAをタンデムに配置させた発現カセットを作製した。
(3) siRNAとsiRNA抵抗性野生型SOD1の共導入アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの作製
共導入カセットを挿入したAAVベクタープラスミドをAAVヘルパープラスミド, アデノウイルスヘルパープラスミドと共に293細胞にトランスフェクションにより一括導入してsiRNA/siRNA抵抗性マウス野生型SODl共導入AAVベクターを作製した。作製したAAVベクターを培養細胞にトランスダクションし, siRNAによって抑制された内因性SOD1の発現がsiRNA抵抗性野生型SOD1により補われていることを定量的RT-PCR及びウエスタンブロッティングにより確認した。
AAVベクターが機能していることを確認できたので, 来年度はマウスへのin vivo投与を行う予定である。
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