| 研究概要 |
組織培養下でウイルスの複製および増殖に関する役割が不明な遺伝子ORF39について、その遺伝子の機能を以下の方法にて検討した。組換え操作の容易化のため、プラスミドベクターにサブクローニングした。プロモーターの範囲、両隣に位置との関係を顧慮した上で、目的遺伝子を欠損させた。欠損遺伝子の範囲をPCR, シークエンスにて確認後、ターゲット遺伝子がコードされているコスミベクターに同部位に組み込みこんだ。今回用いたコスミドベクターはStanford大学の研究グループにより作成されたFsp4, Spe5, Pmee19およびSpe21で、それぞれのコスミドは水痘帯状疱疹ウイルス遺伝子(岡株)の1-33211, 21875-40134, 53877-96188および94208-124884をSupercos vector制限酵素AscI部位に組み込んだものである。細胞への遺伝子導入効果を上げるため、リポフェクション法にてターゲット遺伝子を組替えたコスミドベクターをMW-115細胞に導入した。遺伝子導入を行ったMW-115細胞は細胞変性効果が認められるまで継代したが細胞変性効果が認められたため、欠損させた遺伝子を再度、Spe21のORF65とORF66の遺伝子間に存在するユニークな制限酵素部位であるAvrII部位に組込み、必須で遺伝子の有無を再度、検討する。co-ransfectionで欠損遺伝子の再現が不可能な場合は、ターゲット遺伝子を持続的に発現する細胞株をMW-115細胞用いて作成し、同様にco-ransfectionを行うことでウイルス増殖の必須遺伝子であることを証明する。
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