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<研究目的>CLP36とその結合蛋白に焦点をあて、両者の結合が神経再生において細胞骨格形成で果たす役割を検討する。具体的には、両者の末梢神経障害後の動態、培養細胞での細胞内動態を知る。また、両蛋白および結合部位の欠損や、結合の阻害が末梢神経再生に与える影響を検討する。
<結果>平成20年度研究実施計画に則り、CLP36とpalladin両蛋白の結合の再確認を行った。準備段階で行ったyeast two-hibridの結合証明のみではCLP36とpalladinの生体内での結合を確定しきれないため、新たに購入したpalladin抗体とCLP36蛋白を用いた免疫沈降にて、CLP36とpalladinの結合の再確認を行った。結合の確認は、ラット由来fibroblastより抽出した検体と、ラット脊髄と後根神経節より抽出した検体を用いた。当初、購入業者の手違いによりpalladinではなく、pallidin抗体が納入されたため、実験計画に遅れを生じたが、期間内に免疫沈降反応を用いた両者の結合が、神経組織において確認できた。この研究の過程で、palladinには3つ重量をもつ表現型が存在する事が判明した。また、結合部位としてCLP36のPDZ dmainだけでなく、PDZ dmainとLIM dmainの中間部位でも結合する可能性がある事が判明した。結合の確認と平行して、fibroblastにおけるCLP36とpalladinの免疫染色を行い、両者が細胞骨格を形成するactin filament上に存在する事を確認した。また、神経細胞での局在確認として、ラットより後根神経節細胞の抽出、初代培養を行い、この神経節細胞を用いて、神経栄養因子投与下での伸長神経突起先端での同抗体での免疫染色による免疫組織学的検討により、実際に伸長していく神経突起先端において両者の局在が認められる事を確認した。
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