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胎児遺伝子治療として実際の臨床応用に発展させるために、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いた際のヒト(妊婦・胎児)における安全性について、AAVベクターのベースとなるAAVの妊婦・胎児に対ずる病原性の有無を検討すること及び、臨床応用の際に、有効なAAVベクター血清型を選択するため、妊婦でのAAV抗体保有率を検討することが本研究の目的である。研究計画における平成20年度の主な達成目標は、研究検体の採取及び予備実験による各種アッセイの条件設定である。本研究において検体は羊水及び血液であり、羊水検査をうける妊婦に随時インフォームド・コンセントを行い、同意の得られた妊婦より余剰羊水採取及び採血を行った。血液は血球と血清、血漿のかたちで-80℃で保存、羊水は遠心後のペレットと上清にわけて-80℃にて保存した。適宜、羊水のペレットからDNAを抽出し、4℃にて保存した。一ケ月で十数検体を保存することが可能であった。ただし、平成20年度途中でフリーザーが故障し、それまで-80℃にストックしておいた検体が使用不能になったため、検体採取・保存は平成21年度も引き続き行う予定である。羊水中のウイルスの存在を調べるためにneted PCRの手法を用いる予定であったが、予備実験においてプライマーダイマーができやすいことが判明した。今後プライマーの設計、PCR条件等の調整が必要と考えられた。血中AAV抗体測定には感度の高いELISA法を用いる予定であるが、これらの条件設定は平成20年度の予備実験でおおよそ確定した。しかし、測定にAAV capsidが大量に必要になるため、AAVベクターを作成してそのcapsidを代用する予定であるが、必要なcapsid量を減らせるようELISAの条件設定をさらに検討していく予定である。本研究においてはいずれも高感度のアッセイが必要となるため、予備実験における条件設定の十分な検討が必要である。20年度の予備実験のデータを基に感度の高い羊水中AAV検出及び血中抗体検出が可能であると考えられる。
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