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本研究は、WFS1の内耳における局在部位を確認するとともに、mRNAの発現量を検討することで、内耳におけるWFS1遺伝子の役割を明らかにするとともに、低音障害型感音難聴のメカニズムを明らかにすることを主たる目的としている。低音障害型感音難聴では、高音域〜中音域の聴力は残存することより、蝸牛の回転ごとにタンパク質の発現量の差異などがあることが予測される。そこで、蝸牛を回転ごとに分けてmRNAの発現解析を行うとともに、タンパク質の遺伝子発現量の比が蝸牛の回転ごとに違いがあるか検討し、低音障害型感音難聴のメカニズムを解明したいと考えている。
平成20年度は、マウスを麻酔下におき、4%パラホルムアルデヒドによる経鼓膜及び経心灌流固定を行って側頭骨を固定し、マウスを断頭して内耳を摘出した後、OCTコンパウンドで包埋して凍結切片を作成し、レーザーマイクロダイセクションを用いて、回転ごとに蝸牛より部位の採取およびRNAの抽出を行なう技術基盤の確立を行なった。また、同様に凍結切片を作成し、ABC法に従ってそれぞれの遺伝子に対する特異抗体の蛍光染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡によって局在の解析を行っている。今後、WFS1タンパク質の局在が確認できた細胞を回転ごとにレーザーマイクロダイセクション法を用いて採取しmRNAを抽出する。mRNAは逆転写酵素でcDNAに変換された後、定量的リアルタイムRT-PCRを用いて発現量解析を行う予定である。
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